乳铁蛋白在口腔领域的研究进展

周恬 康娜 (广西医科大学附属口腔医院重点实验室 广西南宁530021)

[摘要] 乳铁蛋白是一种具有多种生理功能的非血红素铁结合性糖蛋白,在抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及免疫 调节方面均有重要作用。乳铁蛋白能促进骨骼生长,在生理浓度下能有效刺激成骨细胞增殖和分化,抑制破骨细胞形成。本文对乳铁蛋白在口腔领域的研究进展进行综述,以期对乳铁蛋白有较全面地了解。 [关键词] 乳铁蛋白 正畸 牙周病 口腔 骨吸收 [文献标识码] A [文章编号] 1671—7651(2019)08—0730

Research Progress of Lactoferrin in Stomatology Medical Domain.Z HOU Tian ,KANG Na.State Key Laboratory of Oral Diseases ,Affiliated Stomatological Hos pital of Guangxi Medical University ,Nanning 530021,Chi- na .[Abstract] Lactoferrin is a non-heme and iron-binding glycoprotein with various physiological functions,which plays an important role in anti-inflammatory,anti-bacterial,anti-viral,anti-tumor,and immune regulation.Lacto- ferrin can promote bone growth,effectively stimulate the proliferation and differentiation of osteoblasts and inhibit the formation of osteoclasts under physiological concentrations.In this article,the research progress of lactoferrin in stomatology medical domain is reviewed in order to give a comprehensive understanding of lactoferrin. [Key words] lactoferrin orthodontics periodontal disease oral cavity bone resorption.

乳铁蛋白 (lactoferrin,LF)是一种分子量为70000 ~ 8000的糖蛋白,由 689个氨基酸残基组成。LF于1960年首先由Groves[1]从牛乳中分离获得。它由哺乳动物外分泌 腺的上皮细胞分泌,广泛存在于乳汁、唾液、汗液等外分泌液 或血浆、中性粒细胞中,属于转铁蛋白家族[2]。研究表明, LF 具有抗微生物、免疫调节和抗炎等多种功能[3]。此外, LF 能够促进骨形成及抑制骨吸收,可以作为一种新型骨生 长因子,通过调节骨的生长代谢从而促进骨骼的生长。随着分离精制技术不断完善,其制作工艺主要有离子交换色谱 法、亲合色谱法、固定化单系抗体法和超滤法。安全性方面, Yamauchi 等进行了大鼠急性口毒性及遗传毒性实验,各 项组织病理学检查均未发现异常。在细菌反向突变实验中, 牛源性LF没有展示出任何诱变潜能,证明牛源性LF 具有良好的食用安全性[5]。由于LF 兼具抗菌和多种生物学功能,现已广泛应用于食品、医疗等领域[6]。乳铁蛋白在口腔领域的应用 1.1 乳铁蛋白与口外骨缺损修复口腔颌面部外伤、肿瘤、 炎症等均可能导致严重的颌骨缺损,目前多采用自体骨、异 基金项目国家自然科学基金(编号:81360170) 作者简介周恬(1 9 9 2 ~ ),男,浙江湖州人,硕士在读,主要从事牙合面畸形的矫治及机理的相关研究。体骨和人工合成骨移植进行修复,但是由于供体部位的缺 损、来源有限以及不可避免的高并发症发生率等原因,利用 组织工程学原理治疗骨缺损已成为该领域的研究热点。近 年来,多项研究结果已经证实,LF 具有体外和体内的骨合成 代谢活性。LF 诱导成骨细胞样细胞的增殖和分化,抑制体 外破骨细胞的生成。LF 在成骨细胞样细胞中的有丝分裂作用主要由低密度脂蛋白受体蛋白-1介导,牛源性LF和人源LF在骨细胞中的作用类似[7]。王卒平等[8]通过体外培 养骨关节炎软骨组织的关节软骨细胞,在实验组细胞培养液中加入不同浓度的人源性 LF,结果显示人源性 LF对人关节软骨细胞的增殖具有促进作用,且具有显著的浓度依赖性。Calvani 等[9]术后应用浸泡牛源性LF 的无菌油纱布对 比传统手术治疗,首次证明了牛源性LF对双膦酸盐相关的 颌骨坏死有修复效果,可以显著缩短伤口的愈合时间。Li 等[10]研 究 发 现,当牛源性LF口服给药的剂量为每天85 mg/kg,可以促进兔模型胫骨牵张成骨后的骨再生,牛源性LF不仅促进了牵张成骨早期的骨形成,而且促进了后期的骨固定化。此外,当使用牛源性LF治疗时,骨保护素(os- teoprotegerin,OPG)/核因子-κB受体活化因子配 体(recep- tor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)/核因子- κB 受体活化因子(receptor activator of nuclear factor κB, RANK)通路可能是在牵张成骨中增加骨形成和减少骨吸收 的主要机制。这一观点 Hou 等[11]在后续研究中也予以证实。Gao 等[1 2]通过在大鼠右侧顶骨制造一个直径 5 mm 大 小的缺损,局部使用明胶凝胶结合牛源性 LF 4~1 2 周,与没 有经过牛源性LF处理的大鼠颅骨骨缺损处相比,发现应用 牛源性 LF 可显著促进大鼠颅骨缺损模型的骨再生。以 研究证明,LF 具有强大的体内、体外成骨活性,是一种潜力 巨大的治疗骨缺损的天然活性物质。 1.2 乳铁蛋白与口腔肿瘤 新近的国内外研究发现 LF 能 在实验动物中抑制肿瘤生长和转移,并在人类多种肿瘤中具 有抑瘤基因的功能。LF 的抗肿瘤机制是由多种机制介导 的。第一,调节免疫作用。LF 可通过调控细胞因子的生成、 增加免疫细胞的数量以及增强免疫细胞的活性而改变肿瘤 的细胞因子环境,从而发挥抗肿瘤效应,增强宿主防御肿瘤 的能力。第二,抑制血管生成。Tung 等[1 3]研究牛源性 LF 通过抑制炎症和血管内皮生长因子的表达来抑制肺癌的生 长,结果证明牛源性 LF 可以抑制血管内皮生长因子 mRNA 和蛋白的表达,从而调控血管生成,抑制肿瘤诱导的血管生 成。第三,调控致癌物代谢酶以及清除铁[1 4]。当 LF 与致癌 剂同时使用时,可作为阻断剂发挥作用,通过减少某些致癌 剂的活化及其诱导的基因毒性,促进致癌剂的排泄。第四, 抑制肿瘤细胞增殖。Wolf 等[15]在体外和小鼠模型中进行对 照实验,评估人重组 LF 能否作为头颈部鳞状细胞癌的化学 治疗剂。结果显示在人和鼠细胞系中,人重组 LF 对鳞状细 胞癌细胞增殖具有抑制作用并呈现剂量依赖性。使用流式 细胞术分析,人重组 LF 诱导肿瘤细胞 G1/G0 期生长阻滞, 这种阻滞受到细胞周期蛋白 D1 下调的调节。在体外模型 中,Luminex 数据 显 示 人 重 组 LF 抑 制 细 胞 释 放 促 炎 性 因 子,包括白细胞介素(interleukin,IL)-8、IL-6 和肿瘤坏死因 子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等。人重组 LF 在细胞 暴露后 4 h 内上调核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)的 细胞活化。在植入头颈部鳞状细胞癌的 C3h/HeJ 小鼠中, 与对照组相比,口服人重组 LF 抑制 7 5%的肿瘤生长。肿瘤 的免疫组织化学分析结果显示人重组 LF 处理组淋巴细胞 增加高达 20 倍。当小鼠耗尽 CD3 + 细胞时,所有人重组 LF 诱导的肿瘤抑制都被消除。据此可知,人重组 LF 可通过直 接细胞抑制来抑制头颈部鳞癌的生长。第五,诱导凋亡[1 4]。 研究发现,在头颈部癌细胞系中,LF 能够改变程序性细胞 死亡相关基因的表达,但其诱导细胞死亡的确切机制需进一 步研究。综上所述,LF 是一种具有实用价值的抗肿瘤药物, 既能作为抗肿瘤药用于多种肿瘤的治疗,也能作为免疫调节 剂应用于肿瘤的辅助治疗[1 6]。 1.3 乳铁蛋白与龋病 龋病作为一种慢性细菌感染性疾 病,可引发全身多部位、多器官、系统性疾病,严重危害人的 全身健康与生存质量。龋病是由多种因素作用所致,主要包 括细菌、口腔环境、宿主和时间。唾液中含有包括 LF 在内 的种类丰富的抗菌蛋白,可有效抑制口腔微生物生长。LF 是一种唾液抗菌铁结合糖蛋白,可保护口腔免受多种病原微 生物的侵害,包括龋齿的病原体———变形链球菌。此外,它 还显示出对抗其他产酸微生物的生物活性,并调节牙菌斑生物膜的聚集和发展,从而影响龋易感性。研究发现,LF 抑制 革兰阳性细菌的作用机制是由于其正电荷与带负电荷的细 菌表面结合,导致细胞壁上的负电荷减少,从而有利于溶菌 酶与细菌细胞壁的肽聚糖相接触以发挥酶促作用,酶解肽聚 糖。Fine 等[1 7]已充分证明唾液 LF 在体外对变形链球菌发 挥杀菌活性,受试者唾液中的 LF 直接地(通过其强碱性 N 末端区域直接与细菌相互作用)和间接地(通过夺取细菌生 长所需的铁离子),具有直接杀死变异链球菌和其他早期形 成的革兰阳性产酸细菌的能力。郝高峰等[1 8]以儿童为研究 对象,通过测定高龋组和无龋组唾液总蛋白和 LF 含量,发 现高龋组总蛋白含量显著低于无龋组,LF 的百分含量显著 高于无龋组,差异有统计学意义。证明唾液蛋白与乳牙患龋 密切相关,唾液 LF 可能是其中一种重要的成分。另外一项 关于唾液 LF 与儿童龋的关系研究显示,儿童早期龋与低浓 度唾液 LF 有关,唾液 LF 的减少可能是儿童龋齿的危险因 素[1 9]。以上研究说明,LF 在乳牙龋病发生、发展过程中可 能起重要作用。 1.4 乳铁蛋白与牙周病 革兰阴性厌氧杆菌如牙龈卟啉单 胞菌是牙周 炎 的 主 要 致 病 菌,其 细 菌 外 膜 成 分 脂 多 糖 (li- popolysaccharide,LPS)是引起牙槽骨吸收的主要因子。Toll 样受体 4(Toll-like receptor 4,TLR4)主要表达于髓系单核 细胞,部分表达于牙周膜细胞,是第一个被发现的哺乳动物 的 Toll 样 受 体,它 可 以 通 过 经 典 的 病 原 相 关 分 子 模 式 (pathogen association molecular pattern,PAMP)识别 LPS, 启动免疫 炎 症 反 应[2 0]。LPS 与 TLR4 通 过 二 聚 作 用 激 活 NF-κB 信号 传 导 通 路,释 放 下 游 炎 症 因 子 如 TNF-α 和 IL-1β、IL-6 等引起牙周组织炎症[2 1]。近年来,越来越多的研 究发现 LF 通过干扰 LPS 引发的 TLR4 免疫反应,可以抑制 LPS 毒性,限制 TLR4 下游信号传导通路中 NF-κB、肿瘤坏 死因子受体相关因子 6(tumor necrosis factor receptor-asso- ciated factor 6,TRAF6)、核因子-κB 抑制蛋白(inhibitory nu- clear factor-kappa B alpha,IκBα)和 IκB 激酶β(inhibit kappa B kinase beta,IKKβ)等因子的活性,从而抑制 LPS 引发的炎 症损害[2 2],避免骨吸收。Yamano 等[2 3]证明口服牛源性 LF 可以 抑 制 鼠 牙 周 组 织 细 胞 分 泌 TNF-α 和 调 节 破 骨 细 胞 RANKL/OPG 的平衡来抑制 LPS 诱导的牙周组织的破坏。 而 Ishikado 等[2 4]以牙周病患者为研究对象,通过口服牛脂 质体乳铁 蛋 白 (liposome bovine lactoferrin,L-bLF)进 行 治 疗,其以大豆磷脂酰胆碱为原料,以片剂形式(每日 1 80 mg bLF)给 1 2 例不同 部 位、牙 周 探 诊 深 度(periodontal depth, PD)超过 3 mm 的受试者服用 4 周的 L-bLF,随后研究人员 对 PD>4 mm 的 5 例受试者中 51 个位点进行了单核细胞化 学活性蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)水平 等的评估。结果发现补充 L-bLF 的患者 PD 和 MCP-1 水平 显著降低。以上研究进一步证明了口服牛源性 LF 作为一 种新型治疗手段,可以有效控制牙周组织炎症。牛源性 LF 对牙龈卟啉单胞菌及生物膜的形成具有抑制作用,能有效控 制免疫炎症反应,避免骨吸收。

1.5 牛乳铁蛋白与正畸 牙移动是由正畸力下的牙及牙周 组织改建所形成的。正畸力下,牙周组织及炎性细胞会释放 IL-1β、IL-6、前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)及 TNF-α 等炎性细胞因子。炎性因子促进压力侧牙周膜内 RANKL 表达的增加和 OPG 的减少,从而使破骨细胞分化成熟,骨组 织改建活跃[2 5]。但是在正畸治疗中,由于青少年患者依从 性较差、牙齿错位以及复杂矫治器的阻挡,保持良好的口腔 卫生相对困难。细菌滋生致使牙周组织释放炎性因子,在炎 症的影响下,正畸力作用于牙齿可能会造成附着丧失,导致 牙周组织破坏。Inubushi 等[2 6]通过细胞实验证明,牛源性 LF 能抑制 LPS/TLR4/TNF-α通路导致的 RANKL 表达升 高,OPG 表达 降 低,但 无 法 抑 制 正 畸 力 下 环 氧 合 酶-2 (cy- clooxygenase-2,COX-2)/PGE2 通 路 引 起 的 骨 吸 收[2 6]。结 合口服牛源性 LF 成功改善牙周炎患者牙周组织炎症的人 体试验,推测牛源性 LF 在一定程度上,似乎能够有效地控 制正畸环境下的牙周组织炎症,而同时不妨碍正畸力下的牙 槽骨改建。LF 可为今后有效控制正畸牙周组织炎症提供新 的临床思路,使牙周组织炎症这一正畸治疗中最为常见及严 重的并发症得到有效的预防、控制和治疗。 1.6 乳铁蛋白在口腔其他领域的应用 LF 在抗病毒感染 方面有很大的作用,一项关于疱疹性口炎的研究结果表明, LF 抑制单纯疱疹病毒主要由其 N 端发挥作用,乳铁蛋白 C 端(345~6 8 9)和 N 端(1~2 80)两大片段可抑制Ⅰ型单纯疱 疹病毒感染[2 7]。低分子质量片段中,位于 N 端 2 2 2~2 3 0 和 2 6 4~2 6 9 两个小肽能有效抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的感染。此 外,牛源性 LF 的抗炎活性可能有助于改善老年人在口腔护 理方面的状况。口腔护理是预防肺炎的一个重要方面[2 8], 然而,对于需要护理的老年人来说,口腔护理是有限制的。 牛源性 LF 的临床应用将有助于减少其并发症。 2 结论和展望 近年来随着人民生活水平的不断提升,人们对保健食品 的关注越来越多。LF 依靠其独特的生理特性,广泛应用于 食品、化妆品、医疗卫生、畜牧等行业。由于 LF 为牛初乳中 的天然蛋白质,可作为新一代疗效性食品的功能组分,防治 口腔疾病。因此,牛乳中 LF 在口腔领域的开发利用具有重 要意义和广阔的开发前景。