前言：

奶酪市场是当前一个引人关注的市场, 也是一个潜力巨大的市场。奶酪几乎不含乳糖, 是乳糖不耐症人群的最佳营养食品, 而乳糖不耐症正是限制东方人消费乳制品的一个重要原因。目前的中国把奶酪定位成一种时尚食品, 倍受消费者亲睐。凝乳酶是奶酪生产中使牛乳凝固的关键性酶，因此，很有必要加强对凝乳酶生产的研究和技术开发。本文从凝乳酶的生产到应用进行了深入研究，为奶酪的工业化生产降低成本铺开道路。

正文：

1、凝乳酶的分子特性和凝乳机理

1.1、凝乳酶的分子特性

凝乳酶的传统来源是哺乳期小牛第四胃(皱胃)。小牛凝乳酶是以前体的形式合成的。经过剪切最后形成具有323个氨基酸残基的有活性的凝乳酶分子。它具有酸性蛋白酶家族的类二折叠对称的特点，与其他真核细胞天冬氨酸蛋白酶有高度同源性^[1]。通过x射线衍射发现凝乳酶是一个带有一个深的、长的裂口的二裂片结构，每个裂片具有相同的折叠。主要催化残基是凝乳酶以口片层结构为主，每个区域的p结构都由正向平行和反向平行的口折叠组成“每个部分都有一砦a螺旋的短片段与口折叠相连，通常一个区域内的口折叠在另一个区域有局部相同的片段。而口螺旋则没有”在N端区域和c端区域的分离裂沟底部发现两个天冬氨基酸活性位点：Asp234和Asp2216”。凝乳酶分子可分为由1—175氨基酸残基组成的N端区域和由176--323氨基酸残基组成的c端区域。两个区域之间是一个深沟状的活性部位。氨基酸残基和水分子在活性位点形成广泛的氢键网状结构以维持凝乳酶的类二折叠对称结构。二硫键Cys2250和cvs2283对于酶的活性有重要意义。如果将这两个二硫键羧基化或汞3钲面菇孺37番F两瓣222凝)化，可使酶活性降低25％。凝乳酶的等电点为pH值为4．2，水溶液的pH值为5．8，对牛奶凝固的最适pH值为5．8。分子量为40．500 U。凝固的最适温度为40-4l℃,制造奶酪时的凝固温度通常为30-35℃，凝固时间为20-40 min。在25～65℃之间随着温度的升高其活力增大，几乎不溶于乙醇．氯仿和乙醚^[2]。

1.2、凝乳酶的凝乳机理

凝乳酶的凝乳过程可分为两步：第一步是凝乳酶专一性的水解乳中K一酪蛋白多肽链105-106位苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键。形成稳定的副K一酪蛋白及亲水性的糖巨肽；第二步是当总的K一酪蛋白被水解掉约85％时．在Caz+存在下在酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝胶。凝胶一旦形成，凝胶中的水分便通过脱水收缩这样一个过程而排出。经过凝乳酶的作用，老蛋白的凝胶网络形成。奶酪的制作过程实质是酶是使牛乳凝固并控制脱水收缩的过程。在此过程中相当数量的凝乳酶随着乳清排出^[3]。但是保留在凝乳中的那部分凝乳酶在奶酪成熟初期能水解a-酪蛋白。其水解程度对奶酪的质地有很大的影响。凝乳酶在奶酪生产中一般认为其对十酪的苦味有一定的贡献。这主要是凝乳酶水解酪蛋白形成苦昧肽引起的。理想的凝乳酶应能专一的打开K-酪蛋白的Phel05--Metl06的键，而水解其他肽键的水解能力低．即两者的活力比值要高。

1.3、凝乳酶活性的影响因素

①.pH：在酸性环境中凝乳酶活力最强，原奶酸度的任何微小变化均能显著影响凝乳酶的活力。凝乳酶活力大部分来源于其中的胰蛋白酶，小部分来源于牛胃蛋白酶（不过猪凝乳酶中的有效成分是猪胃蛋白酶）。胰蛋白酶的最适pH为5。4，而胃蛋白酶的最适pH低于胰蛋白酶。

②.温度：凝乳酶的最适温度是42℃。（到55-60℃，酶本身受到破坏）因为乳温明显影响凝结速度。乳温30℃时原奶凝结时间是42℃的2-3倍^[4]。不过实际奶酪生产中乳温通常保持在30-33℃，一是考虑到乳酸菌的最适温度（比如链球菌属的最适温度在30℃左右，最高不能超过40℃）；二是较高乳温下凝块硬化速度太快，以至随后的切割比较困难。

③.Ca+2浓度：只有原奶中存在自由钙离子时，被凝乳酶转化的酪蛋白才能凝结。因此钙离子浓度将会影响凝乳时间、凝块硬度和乳清排出^[5]。

2、凝乳酶的来源

2.1、动物凝乳酶

动物性凝乳酶主要是胃蛋白酶。此种酶已经作为皱胃酶的代用酶应用于奶酪的生产过程中，其性质在很多方面与皱胃酶相似。但是由于胃蛋白酶的分解能力强，而且其成品奶酪略带苦味，若单独使用，会使产品产生一定的缺陷^[6]。常见的动物凝乳酶有以下几种：

①.小牛皱胃酶   动物凝乳酶中使用最广泛的是小牛皱胃酶。采用小牛皱胃酶生产奶酪时具有较好的凝乳效果，所产奶酪具有硬度和弹性均符合工艺要求，出品率较高，不产生苦味等特点，因此长期以来小牛皱胃酶一直得到人们的青睐。

②.猪胃蛋白酶    实验表明，猪的胃蛋白酶比牛的胃蛋白酶更接近皱胃酶，用它来制作切达奶酪，其成品与皱胃酶制作的奶酪相同。但是猪胃蛋白酶的稳定性较差，容易受热钝化，在单独使用时，奶酪凝块的残留活性低，在奶酪成熟中对蛋白质降解贡献非常小，成熟很慢，并且组织状态较差。

③.羔羊胃蛋白酶   羔羊与犊牛均属于反刍动物，具有相同的生理特点。目前对羔羊皱胃酶的研究比较完善，如张富新等研究了不同因素对羔羊皱胃酶凝乳活性的影响^[7]。还有人研究了羔羊皱胃酶超声提取等方法。但羔羊皱胃酶凝乳性较低影响了它的使用价值。

2.2、植物凝乳酶

许多植物中含有能使乳凝固的蛋白酶，目前全世界约有1% 的凝结剂是从植物组织分离得到的。日本学者研究发现，常见树木中有43种可以凝乳^[8]。目前研究较多的植物凝乳酶主要有以下几种:

①.木瓜凝乳蛋白酶   用木瓜凝乳蛋白酶有效凝乳组分生产的新鲜奶酪如农家奶酪、稀奶油奶酪，以及经短期发酵成熟的软质奶酪如经细菌发酵成熟的手工奶酪和经霉菌发酵成熟的法国浓味奶酪是可行的。利用木瓜凝乳蛋白酶有效凝乳组分生产新鲜的或经短期发酵成熟的奶酪，或再用其生产再制奶酪都可避免因发酵时间太长，造成酪蛋白过度水解而生成苦味肽，导致奶酪风味不良；并且可生产出东方人能接受的新型奶酪制品，可大大促进国人对奶酪的消费，从而促进我国奶酪产业的发展。

②.蔬菜凝乳酶   此酶是从野生的蓟类植物（刺菜蓟、朝鲜蓟）的干花中提取的蛋白酶，在一些传统的西班牙和葡萄牙羊乳奶酪中使用，他们甚至认为使用的效果比犊牛皱胃酶好。虽然没有大规模商业化生产，但是仍在一定地区生产和使用，目前我国还没有使用记录。

2.3、微生物凝乳酶

微生物凝乳酶可以分为霉菌、细菌、担子菌三种来源。有利用前景为:总状毛霉、微小毛霉、根霉、栗疫霉、枯草杆菌和多粘芽孢杆菌等。目前应用最多的是微小毛霉产生的凝乳酶。现在，日本、美国等国将从微小毛霉菌中分离出的凝乳酶制成粉末凝乳酶制剂，应用到奶酪的生产中。另外，还有其它一些霉菌性凝乳酶在美国等国被广泛开发和利用。目前，丹麦奶酪生产中来源于霉菌的凝乳酶得到广泛应用。我国20世纪80年代后期也开始了微生物凝乳酶的研究。目前我国已有多种不同的酶制剂已经进入商业化生产微生物来源的凝乳酶生产奶酪时，成熟奶酪的感官特性与犊牛皱胃酶生产的奶酪接近，主要缺陷是在凝乳作用强的同时，蛋白质分解力比皱胃酶高，奶酪得率较皱胃酶生产的奶酪低，成熟后产生苦味^[10]。另外，微生物凝乳酶的耐热性高，给乳清的利用带来不便。

2.4、基因工程凝乳酶

基因工程的发展可使DNA从一种生物体内转移到另外一种生物体内。因此给出一种适当的序列。合成任何一种酶的能力也可以在生物间转移。这种技术可以使得凝乳酶可以大规模的进行生产。编码小牛凝乳酶的基因有10。5 kb。含有9个外显子和8个内显子。从mRNA得到的cDNA有约1。3 kb。其表达的多态中含有信号肽序列。其在细胞膜分泌表达中起着十分重要的作用。凝乳酶是第一个应用基因工程技术生产的第一种酶。现在用于表达凝乳酶的原合表达系统有：克氏乳酸菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、枯草杆菌和变形杆菌的L型等。真核表达系统有：酿酒酵母、曲霉等。克氏乳酸菌具有良好的发酵属性。产生并分泌入培养基中的分泌物能达到较好的水平。Madzak 等用XPR2启动子调控前凝乳酶基因的表达。其活性凝乳酶的产量明显高于由Y脂肪分解酶启动子调控的凝乳酶表达的产量。大肠杆菌最常用于基冈可隆试验，Sedlacek和Murata等从Lac调控基因和Trp-beta调控基因与前凝乳酶基因构a建在一起，是凝乳酶能在大肠杆菌中表达。但是重组蛋白长以细胞内包涵体形式和成，增加了提纯费用。应用胶木系统，重组蛋白可在七内部进行高水平表达，同时分泌到培养基中。酿酒酵母在凝乳酶的表达中赢得了主要地位^[11]．Moir等人应用凝乳酶原编码序列与酵母信号序列连接表达。信号序列使10％的凝乳酶原从酵母细胞中分泌到培养基中。最近．Ha舢en等人选择了骆驼单结构域抗体片断。研究了对凝乳酶表达的促进作用，结果表明：与骆驼单结构域抗体片断复合表达，在酿酒酵母中可以刺激凝乳酶分泌量提高1．5到6倍。米黑氏霉菌、黑曲霉、寄生毛霉菌等是霉菌中转人凝乳酶基因表达效果比较好的菌株。由于丝状真菌中的曲霉菌具有遗传背景清楚、生长迅速、易于培养并可大量产生分泌性蛋白质的特点，而其中的黑曲霉菌是一种不产生黄曲霉毒素的安全真菌。因此．它除了在生产各种真菌代谢物及酶类的发酵工业上被广泛应用外，在应用于基冈工程生产外源蛋白质产物方面也受到很大重视。Cardoza RE和Gutierrez S构建的两种质粒在黑曲霉中都可以表达产生牛凝乳酶。围绕在许多真菌和细菌中活性凝乳酶合成的中遇到的问题，Klessen等人开发了一种重组DNA的L型表达系统。该系统指导凝乳酶原全部分泌到细胞外培养基中旧。大大减少了纯化费用。基因工程生产的凝乳酶与天然的凝乳酶有相似的结构．都对，c一酪蛋白的105--106肽键有特异性．1990年美国FDA已经批准基因工程凝乳酶可以在奶酪中使用．俄罗斯科学家培育出的转基因母绵羊可以产生汉凝乳酶的羊奶^[12]．其凝乳酶与小牛皱胃凝乳酶在分子量、pH值稳定性和氨基酸组成方面无差别㈤。基因工程凝乳酶的研制取得了一定的进展．目前正尝试应用强启动子和通过蛋白质工程来高效表达．应用基因工程凝乳酶加工出的各种奶酪产品．与天然凝乳酶加工的奶酪进行了对比评价．在凝固体的收复、成熟工程中蛋白水解、最终奶酪产品的特性等方面。没有监测到显著差异。

2.5、蛋白质工程凝乳酶

凝乳酶蛋白质工程的研究已经在解释酶的某些结构与功能性质、基团与功能性质、酶的翻译和激活等方面取得了一定成效．在试图改变酶的某些性质方面也做出了尝试．中科院微生物所在位点21到24的氨基酸残基通过位点定向突变．研究了凝乳酶结构域的功能，用GG(GG是同源蛋白青霉天冬酰蛋白酶的邓加环残基)，或SG和GS替代，研究r凝乳酶21—24环的作用。突变体除了GTPP(21—24)。都能在大肠杆菌中表达．凝乳酶具有的局部氖键网络结构包含有活性位点天冬氨酸与其周围的残基．这些残基对底物裂解的速率和最适pH值有重要影响。Mantafounis与Pitts和Pitts等评价r位点定向取代作用．设计的位点定向取代不仅影响了底物pH值．同时也影响了底物特异性。利用此方法研究了酶活性中心与周围残基的作用。Mark等应用凝乳酶B定点突变体A115T和G243D(凝乳酶A)研究了其它残基对酶功能性质的作用。Wang等人通过SD序列和启动子玉SD信号上游的区段进行突变，研究了在法医水平上大肠杆菌中凝乳酶原cDNA表达的调控，可以使凝乳酶原高效表达，达到细胞总蛋白的39％。凝乳酶蛋白质工程仍然是一个广大的研究领域^[13]。蛋白质工程可以潜在的增强凝乳活性，改善底物户专一性、改变热稳定性和最适pH值，将来必将为凝乳酶的开发和利用做出应有的贡献。

3、凝乳酶在奶酪生产中的应用

3.1、奶酪的加工工艺

原料乳→标准化→杀菌→冷却→添加发酵剂→调整酸度→加氯化钙→加色素→加凝乳剂→凝块切割→搅拌→加温→排出乳清→成型压榨→盐渍→成熟→上色挂蜡^[14]

①.温热牛奶   将牛奶放入双层加热锅，并缓慢加热到32摄氏度，加入用牛奶融化后的发酵剂，并搅拌5分钟，充分均匀。然后静置一个半小时，再加入用纯净水溶解的凝乳酶稍加温到40度，再静置30分钟。本阶段有个中间加热的环节，希望大家不要忘记。

②.切割凝乳   牛奶经过发酵剂的发酵产酸、凝乳酶的凝结作用，这时候的牛奶已经成块了，就要准备切割凝乳，有一个把握切割时机的方法，那就是用手插入凝结的牛奶块中，缓缓向上捞起，牛奶块呈现北方豆腐脑搅动的破裂形状。这时候你就要抓紧时间了。

切割凝乳，并不是用菜刀来进行的，而是U型刀，工厂用切割栅。如果你实在找不到，你可以想任何办法，把凝乳切割成2厘米见方的凝块，在这种状态下置放10分钟。

③.凝乳搅拌加温   静置10分钟后，你需要轻轻搅拌，是搅拌而不是搅碎。用勺子背，朝一个方向慢慢搅拌10分钟，半透明的乳清，就会迅速排出。放入一个金属网篮（目的是隔开凝乳，方便舀乳清）把锅内乳清舀出1/3。拿出金属篮，慢慢添加热水，一边添加一边搅拌。用5分钟左右时间，将温度上升到40摄氏度，然后置放20分钟，再次搅拌，直到粉碎，就像渣状。

④.加压   把这些凝乳碎块，放到纱布中过滤，并且轻轻挤压，排除乳清。凝乳连带纱布，放入盆中，上面压一块干净的重物，可以是加工后的石块。静置30分钟，等待乳块进一步发酵。

⑤.成型   取出变硬的凝乳块，切割成3-4厘米的长方形，一起放入带孔的模具，带孔是为了方便继续排出乳清。上方套入一个小的同形模具，放上石块继续加压。因为这次石块不能直接压到凝乳块上了。这次的加压，需要1小时。

⑥.加盐   取出凝乳块，正反倒置后重新包裹加压6-8小时。取出凝乳表面喷雾一些医用酒精消毒，然后在乳块表面洒上食盐，这样可以防止杂菌。但食盐一定要卫生新鲜的。

⑦.成熟干燥   把奶酪在常温下（25摄氏度）干燥3天，再用酒精喷洒一遍消毒。继续存放3-4天。并把奶酪完全密封，存放在5摄氏度冰箱内2-3周，等待最后成熟。

3.2、奶酪中的凝乳酶

①.凝乳酶的添加：1%的食盐水将酶配成2%溶液，并在28_~32℃下保温30min。然后加入到乳中，充分搅拌均匀(2_~3 min)后加盖。

②.凝乳的形成：添加凝乳酶后，在32 ℃条件下静置30min左右，即可使乳凝固，达到凝乳要求^[15]。

4、凝乳酶生产的前景展望

我国新疆穆斯林民族有食用奶酪的传统习俗，但从整体上看，食品奶酪的人并不多。近几年随着我国液体乳的快速发展，越来越多的企业及科研单位开始重视奶酪的开发，奶酪的制作工艺在国内已经广为传之。然而，奶酪的味道并不能为大部分人所接受，这是制约着奶酪在国内市场发展的重要因素之一。因此从各个方面了解奶酪的成熟机理，改善优化奶酪的口味，使之为我国人民所接受有着重要的意义。与此同时，我们知道发酵食品的风味与微生物有着不可分割的关系，所以微生物在奶酪发酵成熟的作用是现在也应该是未来我们所关注的一个方向。

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本文引用《食品酶工程学专业文献》